Gelibolu'da doğdu. Erken yaşlarda eğitime başladı ve geleneksel İslamî ilimleri tahsil etti. Gelibolu'da başlayan eğitim hayatını Şehzade Camii hatibi olan büyük dayısı Derviş Çelebi vasıtasıyla sırasıyla İstanbul'da Rüstem Paşa, Haseki, Tetimme ve Semâniye'de (Sahn-ı Seman) tamamladı (Aralık 1560). Medrese eğitiminden sonra yirmi yaşında iken Mihr ü Mâh isimli eserini sunduğu Şehzade Selim'in kâtipleri arasına katılarak müteferrika payesiyle bürokratlığa adım attı. Bürokrasiye dahil olsa da ilmiyeye olan ilgisi devam etti. Gelibolulu Mustafa Âlî ömrü boyunca İstanbul, Kütahya, Halep, Şam, Kahire, Manisa, Klis (Hırvatistan), Banyaluka (Bosna), Trabzon, Erzurum, Bağdat, Sivas, Kayseri, Amasya ve Cidde gibi birçok yerde farklı görevlerde bulundu. Ancak bu görevlerin hiçbirinde aradığı tatmini bulamadı. Bu arzunun bir yansıması olarak hayatı boyunca âlim, kalem ehli, şair ve yönetici olarak topluma hizmet etmeye çalışmış ve içinde yaşadığı toplumun sorunları üzerine tefekkür etmiştir. Yaşı kırk bire geldikten sonra Osmanlı Devleti'nin işleyişi ve işleyişin zaafları üzerine düşünen bir kişiliğe büründü.

Heft Meclis adlı eserini Sadrazam Sokullu Mehmed Paşa'ya sunmuş ancak umduğu zeâmet yerine, kendisine o dönemde Kilis sancak beyi olan, daha sonra Bosna beylerbeyi olacak Gazi Ferhad Paşa'nın divan kâtipliği verilmiştir. Kilis ve Bosna'da sakin bir dört yıl geçirmiş, III. Murad'ın padişah olması üzerine İstanbul'a gelerek padişaha bazı eserlerini arzetmiştir. Fakat istediğine ulaşamayınca yeniden Bosna'ya dönmek zorunda kalmış, eser telif etmeye ve bunlardan bir kısmını İstanbul'a göndermeye devam etmiştir. En son Zübdetü't-Tevârîh isimli eserini sunduğu padişahtan bu vesile ile nişancılık görevini talep etmişse de bu isteği de kabul görmemiştir.

III. Mehmed'in padişah olması üzerine telifine başladığı Künhü'l-ahbâr için bol kaynak bulacağını umduğu Mısır defterdarlığına tayinini istedi, fakat Amasya sancak beyliği ve Rumeli defterdarlığı ile yetinmek zorunda kaldı. 1599'un ilkbaharında Şam beylerbeyiliğine atanmışsa da görev yerine ulaşmadan azledildiğinden bu atama kâğıt üzerinde kaldı. Son olarak Cidde sancak beyliğine tayin edildi, 1600 senesi başlarında Cidde'ye giderek son eseri Mevâidü'n-Nefâis'i Mekke'de tamamladı. Sancak beyliği yaptığı sırada 1600 yılında Cidde'de vefat etti.

Mustafa Âlî'nin devlet adamlığı, edebî kişiliği ve tarihçi yönü kadar eğitimciliği de ön plandadır. Ortaya koyduğu eserler ve işlediği konular bu konuda önemli ipuçları vermektedir. Bu anlamda öğrenci ve kâtiplere inşa sanatını öğretmek üzere kaleme aldığı Nusretnâme isimli eserini sade bir dille yazmıştır. İyi bir hattat da olan Gelibolulu Mustafa Âlî, İstanbul'un tanınmış hattatlarından Pîr Mehmed Dede'den sülüs ve nesih dersleri almıştır.

İlim için çıktığı yolda, kendini bürokrasinin içinde bulan Mustafa Âlî'nin medrese ve ilmiye sınıfı hakkında ortaya koyduğu tespitler ve tenkitler çok önemlidir. Eserlerinde Lutfi Paşa'nın Âsafnâme ve Kınalızâde'nin Ahlâk-ı Alâî'de kullandığı dilden farklı olarak, "fi-zamâninâ" diyerek kendi dönemindeki uygulamada ortaya çıkan aksaklıkları tek tek sıralamıştır. Künhü'l-ahbâr'da medreselerin bozulması ve ilmiye sınıfı hakkında eleştirilerini dile getirir. Asıl görevi ilim öğretmek olan müderrislerin bir kısmının ayda bir defa dahi medreseye uğramadıklarını, gittikleri zaman da karşılarında ders verecek talebe bulamadıklarını ifade eder. Ulema sınıfının bazılarının rüşvet, lüks, gösteriş ve israfa meyilli olmaları konusundaki eleştirilerinin bir kısmı şahsî gözlemlerine dayanır. Ulemanın eser telif etmede başarısız olduğunu ifade eden Mustafa Âlî, Ebüssuûd dışında kendi zamanındaki hiçbir âlimin ciddi bir eser vermediğini iddia eder. 1591 yılında Mısır kadılarından ilimden nasibini almamış avamdan meçhul bir zatın dirhem ve dinar harcayarak kadı olması ve akranlarının önüne geçmesiyle ilgili bazı eleştirilerinde somut iddialarda da bulunur.

Mustafa Âlî'nin eğitim hakkındaki düşünceleri çağdaşı tenkitçi yazarlarınkinden farklı değildir. Bu dönemin düşünürlerine göre fert ile devletin mutluluğu demek olan umran ancak ruh, edep ve akıl eğitimiyle mümkündür. Gelibolulu Mustafa Âlî için devlet idaresindeki aksaklıklar toplumsal ve bireysel eğitimin yetersizliğinden kaynaklanmaktadır. Bu bakımdan sıbyan mektebinden başlayarak medrese ile devam edecek şekilde doğru ve adaletli bir biçimde tasarlanmış örgün eğitim huzurlu toplumsal düzenin kaynağıdır. Dolayısıyla Mustafa Âlî'ye göre eğitim mutluluğa erişmede bir araç olup devletin düzen içerisinde idare edilebilmesinin gereğidir. Mustafa Âlî'ye göre medreselerin ve ilmiyenin bozulmasının en önemli sebebi liyakat sahibi olmayanların, bilhassa mollazade, hocazade ve şeyhülislam çocuklarının müderris ve kadı atanmaları, layık olmadıkları yüksek gelirli mevkilere getirilmeleri eski ölçülerin ortadan kalkmasıdır. Rüşvet ve iltimas ile kadılıklara tayinler yapıldığına değinerek hak etmeyenlerin bu makamlara gelmelerini eleştirir. İkinci sebep olarak kazaskerlerin mülazemet sisteminde yolsuzluk yaparak müderrislik ve kadılık gibi önemli görevleri dağıtmalarını görür. Ona göre bozulmanın diğer bir sebebi ilmiyeye iltimas yoluyla adam alınmasıdır. İltimasın artması karşısında Osmanlı yönetiminin ideal olarak liyakat ilkelerine dayandığını ifade eden Mustafa Âlî, iltiması önlemek adına yükselme ve atamalarda sınav usulünün uygulanmasını sıklıkla dile getirir. Değişim ile bozulmayı da bir tutarak bu anlamda önemli bir tespiti de ayrıca ortaya koyar. Çünkü kendisi XVI. yüzyılın sonlarına doğru hicrî II. binin başlarında Osmanlı toplumunda meydana gelen sosyopolitik ve siyasî çekişmelere yakından şahit olmuştur. Bozulma konusundaki en büyük eleştirilerinden biri ilim sahibi kimselerle cahillerin aynı görülmesi ve ilim sahibi kimselere değer verilmemesidir. Eleştirilerin de aşırıya kaçmasının ve hırçın bir tavır takınmasının altında yatan sebeplerden biri de istediği bir göreve getirilmemesi ve kendisinin bir kenara itilmiş olmasıdır. Buna rağmen samimi eleştirilerine devam ederek devlete olan sevgi ve güvenini korumuştur. Çünkü Mustafa Âlî, Osmanlı medreselerinin en ihtişamlı döneminin yetiştirdiği aydın, âlim ve bürokrat biridir.