1453'te fetihten sonra Ayasofya'yı ziyaret eden Fâtih Sultan Mehmed, fethin ve saltanatın sembolü olarak Ayasofya'yı bir külliyeye dönüştürdü. O zamana kadar görülmemiş bir şekilde yüzlerce dükkânı, evi, çarşıyı, han ve hamamı gelir kaynağı olarak Ayasofya'ya vakfetti. Öncelikli olarak avlu içerisinde medrese inşasını irade buyurdu. Ayasofya Medresesi'nin inşası tamamlanıncaya kadar mabetteki papaz odaları eğitim için tahsis edildi. Molla Hüsrev'in önce bu odalarda tedris faaliyetini başlattı.

Ayasofya'nın kuzeybatısında tek katlı olarak inşa edilen medrese binası 1460'lı yılların ortalarında tamamlanıp İstanbul'un ilk müstakil medresesi olma ayrıcalığına sahip olmuştur. Sahn-ı Seman medreseleri tamamlanınca muhtemelen oraya rağbeti arttırmak için Ayasofya Medresesi'nde eğitime bir süre ara verildiği bilinmektedir. II. Bayezid Ayasofya-yı Kebîr Medresesi'ne ikinci bir kat ekleyerek oda sayısını fazlalaştırdı.

Ayasofya Medresesi'nin kuruluşu ve programının belirlenmesinde ilk iki müderris Molla Hüsrev ile Ali Kuşçu'nun ihtisasları önem taşımaktadır. Molla Hüsrev'in fıkıh ve usûl-i fıkıh dersleri, Ali Kuşçu'nun matematik, astronomi, ilm-i kelam derslerinin Ayasofya Medresesi'nin programında ağırlıklı olarak yer bulmuştur. Fâtih ağır sorumluluğu olan İstanbul kadılığına ilaveten Ayasofya-yı Kebîr müderrisliğini Molla Hüsrev'e vermekle ve hususi olarak Osmanlı ülkesine davet ettiği Ali Kuşçu'ya Ayasofya müderrisliğini vermekle bu âlimleri taltif etmiştir.

Kurulduğu andan itibaren Ayasofya Medresesi ve müderrisliği yüksek bir itibara sahip olmuş, Ayasofya Medresesi'nin yüksek seviyesi Fâtih Kanunnamesi'nde "Sahn'dan beş yüz akçe kadılığa vüsul bulunur ve Ayasofya Medresesi'nden dahi kezalik böyle vüsul bulunur" cümlesiyle ifade edilmiştir. Uygulamalardan hareketle Ayasofya Medresesi'nin seviyesi hakkında daha sağlıklı bilgi vermek mümkün olmaktadır. Bu göreve tayin edilmeyi ilim adamları bir ayrıcalık olarak görmüşlerdir. Bu gelenek daha sonraki dönemlerde de devam etmiş, Ayasofya müderrisliğine daima ilmiyle ve eserleriyle temayüz etmiş olan bilginler tayin edilmiştir. Nitekim Hüsâmeddin Tebrîzî'ye Sahn müderrisliği verildiği zaman, Tebrîzî, asıl arzusunun Ayasofya müderrisliği olduğunu Fâtih'e münasip şekilde ifade edince bu talebi kabul edilmiştir. Molla Hâfızüddin, Şah İsmâil'den kaçarak Anadolu'ya gelmiş, birçok medresede görev yaptıktan sonra ilmi ve eserleri sebebiyle Kanûnî Sultan Süleyman tarafından Ayasofya müderrisliği ile ödüllendirilmiştir.

Osmanlı medreselerinde faklı dönemlerde, farklı kriterlere göre seviyeler belirlenmiştir. Nitekim XV. yüzyılda Sahn-ı Seman'dan sonra, XVI. yüzyılda ise Süleymaniye medreselerinden sonra medrese derecelendirilmeleri yapılmıştır. Ayasofya Medresesi bu derecelendirmelerde isim olarak yer almamakla birlikte XVI. asır ortalarına kadar Ayasofya ve Eyüp medreselerinin Sahn derecesinde addedildiğini, bu asrın ikinci yarısından itibaren Ayasofya'nın Sahn-ı Seman'dan bir derece yüksek sayıldığını uygulamalar göstermektedir. Şekaik'te ve bilhassa Atâî'nin zeylinde, mesleğinde başarılı olmuş Şeyhülislam Hâmid Efendi, Sipâhîzâde Mehmed, Mehmed Beyzâde Efendi, Saçlızâde Abdülvehhab Çelebi, Hâc Hasan, Hacı Hasanzâde, Mevlâ Fuzayl gibi birçok âlimin sırasıyla Fâtih, Ayasofya ve Süleymaniye medreseleri müderrislikleri akabinde Şam, Bağdat, Kahire gibi hilafet merkezi olmuş şehirlere kadı olarak tayin edildikleri takip edilebilmektedir. Bu şekildeki kariyer bir kaide olmamakla birlikte bir teamülü göstermektedir. Baltacı, XV-XVI. Yüzyıllarda Osmanlı Medreseleri adlı kitabında 1459-1584 yılları arasında, Ayasofya-yı Kebîr Medresesi'nde peş peşe müderrislik yapan otuz beş âlimin isimleri ve kariyerlerini vermektedir. Bunların büyük çoğunluğunun yukarıda belirtilen medrese ve kadılık silsilesini takip ettiği görülmektedir.

Ayasofya-yı Kebîr Medresesi müderrisliğinden emeklilik konusu da önemli olup, müderrislerin kıdemlerine, padişah nezdindeki itibarlarına göre, yevmî 70 akçeden 200 akçeye kadar farklı miktarlarla emekli olduklarına dair biyografik eserlerde bilgiler bulunmaktadır.

Ayasofya-yı Kebîr Medresesi'ndeki eğitim ve bilimi, Ayasofya'nın bütünündeki faaliyetlerden ayrı düşünmek eksik bir değerlendirme olur. Ayasofya Camii'nde düzenli olarak verilen, bazan padişahların da dinleyici olarak hazır bulundukları dersler, camide yapılan ilmî faaliyetler, Ayasofya kürsü şeyhliği, padişahların buradaki cuma selamlıkları sırasında yaşananlar, Ayasofya Kütüphanesi, Ayasofya'da icra edilen yargılamalar ve camide yapılan müderrislik imtihanları bir bütün olarak Ayasofya'daki bilim ve kültür faaliyetlerini oluşturmaktadır.

İslam dünyasında bir gelenek olarak derslerin birçoğu medresenin de içinde yer aldığı külliyenin camisinde verilirdi. Ayasofya Medresesi derslerinin de Ayasofya Camii'nde yapıldığı, ayrıca tanınmış bazı âlimlerin emeklilik sonrası hususiyle Ayasofya'da dersler verdiği bilinmektedir.

Medrese imtihanları genellikle Fâtih ve Ayasofya camilerinde yapılırdı. Ayasofya'da yapılan bir imtihan ayrıntılı bir şekilde Atâî'de anlatılmaktadır: 1528'de Fâtih medreselerinden birinin müderrisliği boşalınca Sahn pâyesiyle Edirne Dârülhadisi müderrisi Kılıççızâde İshak Çelebi, Edirne Üç Şerefeli müderrisi Çivizâde Muhyiddin Mehmed ve Bursa Sultâniye müderrisi İsrâfilzâde Fahreddin efendiler başvurmuşlardı. Rumeli Kazaskeri Fenârîzâde Muhyiddin ve Anadolu Kazaskeri Kadirî efendiler huzurunda Ayasofya Camii'nde yapılan imtihanda cevapları ihtiva eden risaleler değerlendirilmiş, ayrıca kendi aralarında cevaplarıyla ilgili tartışma da düzenlenmiştir. Ayasofya'da icra edilen önemli ilmî faaliyetler vekayi'namelerde nakledilmektedir. Nitekim Hoca Sâdeddin Efendi'nin her cuma günü Ayasofya-yı Kebîr Camii'nde halkın dinî ve toplumsal konulardaki sorusuna üç dildeki (elsine-yi selâse) yüzlerce fetvalarıyla cevap verdiği bilinmektedir.

Ayasofya kürsü şeyhliği başlı başına bir dinî-ilmî faaliyet idi. Bu makam kürsü şeyhlikleri arasında en yüksek olanı idi. Bu görevi yapanlar aynı zamanda birer tekke şeyhi olduklarından bu isimle anılırlardı. Müstakimzâde, Ayasofya-yı Kebîr'e Şeyh Olanlar adlı risalesinde, XVII. yüzyıl başlarında ilk defa bu göreve tayin edilen Şeyh Mehmed Hamîdî'den başlayarak XVIII. yüzyıl sonlarına kadar Ayasofya şeyhliğine tayin edilen on bir âlim şeyhin hayat hikâyesinden bahseder ve bu görevin özellikleri hakkında da yer yer bilgiler verir (TSMK, Emanet Hazinesi, nr. 1719, vr. 289^b-293^b). Bu âlimler, o dönemde genellikle sadece Arapça olarak okunan hutbeleri cuma namazından sonra halka açıklayıcı vaazlar verirlerdi. Kürsü şeyhleri şeyhülislamlık makamı tarafından tayin edilir ve kendilerine vakıf gelirlerinden ücret ödenirdi.

Ayasofya kürsü şeyhleri protokolde en önlerde yer alırlardı. Cülus ve mevlitlerde, sünnet şenliklerinde, sultan düğünlerinde, cami, medrese açılışlarında yapılan merasimlerde hazır bulunurlardı. Hükümdarlarla birlikte sefere katılırlar, yol boyunca zaman zaman sohbet ederlerdi. Padişahların iştirakiyle Kadir gecesi ve Mevlit kandillerinin ihyası da Topkapı Sarayı'na yakınlığı sebebiyle genellikle Ayasofya'da olurdu. Nitekim Ayasofya'da bir Kadir gecesinde güzel sesiyle Kur'an okuyan Evliya Çelebi, IV. Murad'ın dikkatini çekmiş ve Enderûn-ı Hümâyun'a alınmıştır.

Ayasofya Kütüphanesi'nin Fâtih döneminden başlayarak devamlı geliştiği, özellikle Sultan I. Mahmud'un kurduğu kütüphanede dersiâm, muhaddis ve şeyhülkurra gibi zengin bir ilmî kadro ile haftanın belli günlerinde öğrencilere dersler verildiği bilinmektedir.

Ayasofya'da ve medresesinde her dönemde imar ve tamir faaliyeti olmuştur. En yoğun tamir ve imar faaliyetleri Fâtih, II. Bayezid, II. Selim, III. Murad, I. Ahmed, I. Mahmud, II. Mahmud, Abdülmecid ve Abdülaziz devirlerinde yaşanmıştır. Sırasıyla medrese, minareler, türbeler, abdesthane, şadırvan, sıbyan mektebi, kütüphane, imaret, hünkâr mahfili, hünkâr sofası ve muvakkithane külliyeye eklenmiştir. Şeyhülislam Mekkîzâde Mustafa Âsım Efendi, 1846'da ölünce geride büyük bir servet bırakmış, evladı olmadığından vasiyeti üzerine bu servet Ayasofya Camii'nin tamirine harcanmıştır.

XIX. yüzyıl medreselilerin maddi manevi büyük değişimler ve sıkıntılar yaşadığı bir asır olmuştur. 1873 senesinde medrese tamamen yıktırılmış, talebesi ise çevredeki medreselere yerleştirilmişti. Bu durum büyük huzursuzluğa sebep olmuş, Şeyhülislam Ahmed Muhtar Efendi'nin (ö. 1875) sadarete gönderdiği tezkiresi üzerine inşaat ve maliyet hesapları yapılarak medrese kâgir olarak yeniden bina edilmiştir.

Mubahat Kütükoğlu, arşiv kayıtlarından istifade ile muhtelif tarihlerde Ayasofya-yı Kebîr Medresesi'nde ikamet edip okuyan talebe sayılarını tespit etmiştir. Buna göre 1792 sayımında medresenin üst kat odalarında kırk sekiz, alttaki odalarında elli dört olmak üzere yüz iki kişi ikamet ettiği, 1869'da ise medresede on dersiâm, yedi mezun, iki Celâlî talebesi, üç Kadimir, dört Şerh-i Akâid, altı Tasdikat, yirmi Tasavvurat, on iki Fenârî, altmış dört Kafiye, kırk İzhar, otuz Sarf talebesi olmak üzere yüz doksan sekiz kişinin kaldığı belirlenmiştir. 1914 medrese ıslahatında Dârülhilâfe medreseleri bünyesine alındığında Ayasofya-yı Kebîr Medresesi'nde alt katta on dört, üst katta on sekiz olmak üzere farklı ebatlarda otuz iki odanın bulunduğu, her iki katta birer helanın yer aldığı ayrıca genişçe bir iç avlu, şadırvan, gusülhane ve çamaşırhane mevcut olup, yüz üç talebenin ikamet ettiği belirlenmiştir.

1924'te Tevhîd-i Tedrisat Kanunu ile medreseler kapatıldıktan sonra Ayasofya Medresesi binası İstanbul Belediyesi tarafından öksüzler yurdu olarak kullanılmış, 1934'te Ayasofya müzeye dönüştükten sonra çeşitli sebepler ileri sürülerek medrese binası yıktırılmıştır. Ayasofya Müzesi Müdürü Muzaffer Ramazanoğlu, 1948'de IV. Tarih Kongresi'nde sunduğu tebliğinde, Ayasofya Medresesi'nin yıktırılmasının oradaki kiliseyi aramak için olduğunu ifade etmiştir.

Fâtih tarafından inşa ettirilen ve İstanbul'un ilk medresesi olma özelliğine sahip olan Ayasofya Medresesi aslına uygun olarak 2022'de yeniden inşa edilerek bilim ve eğitim faaliyetleri için Fatih Sultan Mehmet Vakıf Üniversitesi'ne tahsis edilmiştir.